主要特性:

^{1．产酶菌株具有应用安全性}

^{GS-壳聚糖酶的生产菌株Bacillus subtilis GF07是我公司自行选育的一株枯草芽孢杆菌。}

^{壳聚糖酶制剂作为功能性食品专用酶，其生产菌株的安全性至关重要。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是当今工业酶的主要生产菌种之一，也是不产生毒素和对人体没有病原性的安全菌种。}  

^{2．GS-壳聚糖酶制剂的主要有效成分是壳聚糖酶（CHITOSANASE  EC 3.2.1 .132），没有外切壳聚糖酶的活性，十分适合于制备壳寡糖}

^{壳聚糖酶为内切型的专一性水解壳聚糖的酶*。GS-壳聚糖酶制剂中几乎检测不到外切-β-D-氨基葡萄糖苷酶（exo-β-D-glucosaminidase）[即外切型壳聚糖酶（Exo-Chitosanase）] 和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D- glucosaminidase）的活性。因此可以避免壳聚糖酶降解壳聚糖产生的寡糖被N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和/或氨基葡萄糖苷酶进一步分解为单糖，壳寡糖产物的产率高，聚合度≥3，特别是聚合度4以上的壳寡糖产率较高。}  

^{*2004年国际生物化学与分子生物学学会酶学委员会对壳聚糖酶（chitosanase EC 3.2.1 .132）修改后的定义是：内切型水解部分乙酰化壳聚糖内部的D-氨基葡萄糖残基之间的β-1，4连键的酶类（Chitosanase is now defined as the enzyme performing endohydrolysis of beta-1,4-linkages between D-glucosamine residues in a partly acetylated chitosan）}

 ^{3．GS-壳聚糖酶催化水解壳聚糖，在较为充分水解的情况下，其主要产物是聚合度为3-13的寡糖。其中5-10糖的相对含量达40%。在有限度水解的情况下，5-10糖的相对含量可以高达80%以上。}

^{GS-壳聚糖酶催化水解部分乙酰化的壳聚糖，其水解产物壳寡糖的聚合度分布范围与作为原料的壳聚糖的脱乙酰度密切相关，一般情况下，用脱乙酰度较高的壳聚糖作原料，易产生聚合度较低的均一壳寡糖[氨基葡萄糖的寡聚物（GlcN）n]，5-10糖的相对含量约为40%左右；用脱乙酰度较低的壳聚糖作原料，易产生聚合度较高的壳寡糖，其中有一部分非均一壳寡糖[氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖按一定比例组成寡聚物（GlcN）x（GlcNAc）y   x+y=n]，5-10糖的相对含量达80%或更高。（参见我公司的酶解产物壳寡糖的检测报告）}  

^{4．GS-壳聚糖酶十分适于壳聚糖的可控酶解反应，制备具有特定聚合度和狭窄分子量分布范围的壳寡糖产品。}

^{酶解法制备壳寡糖工艺中，使用具有稳定质量指标（特别是分子量和脱乙酰度）的壳聚糖作原料，控制酶解反应的条件[温度、pH值、壳聚糖原料的重量，酶制剂的酶活力和投入量（酶底比），酶解反应终止的时间等因素]，可以得到具有稳定质量标准（聚合度分布范围，平均分子量和分散度等指标）的壳寡糖产品。（详见GS-壳聚糖酶的使用说明和酶解产物检测结果及分析）}  

^{5. GS-壳聚糖酶制剂中可能同时具有Type I和Type III两类壳聚糖酶的活性，可以制备一定量的几丁寡糖}

^{使用该酶制剂催化水解乙酰基化程度较高的的壳聚糖时，可以产生一定量的几丁寡糖 [均一的乙酰氨基葡萄糖的寡聚物（GlcNAc）n] 。因此可以断定，GS-壳聚糖酶制剂可能同时具有Type I和Type III两类壳聚糖酶的活性，可以识别并催化水解壳聚糖分子中的GlcN-GlcN、GlcN-GlcNAc和GlcNAc-GlcN残基间的糖苷键，因此可以成生几丁寡糖（特别在使用脱乙酰度较低的壳聚糖作原料的情况）。}

目前壳聚糖酶制剂的酶活性多用单位时间内产生还原糖的量规定酶活力单位，但测定酶活力时，由于没有标准的壳聚糖作底物，测定酶活性时所使用壳聚糖的分子量和脱乙酰度不同，测得的酶活力不尽相同，，一般壳聚糖酶制剂标注的酶活力数值只能作为参考。另一方面，还原糖产生速率高，只能说明单糖和低聚合度的寡糖（如二糖）产生的速率高，对于聚合度较高的壳寡糖的制备不一定适用。

由于GS-壳聚糖酶主要有效成分是内切型的壳聚糖酶，酶解产物中几乎没有单糖和二糖，产物的还原性相对较低，所以不适合用单位时间内产生还原糖的量来规定该酶制剂的酶活力。GS-壳聚糖酶的酶活力采用单位时间内底物壳聚糖的减少量来规定：在45℃, pH5.4条件下，一分钟转化一毫克壳聚糖为水溶性组分的酶量为一个活力单位（一般底物为高黏度的食品级壳聚糖，底物浓度为3%-6%）。使用已知酶活力的GS-壳聚糖酶，在明确了原料壳聚糖的重量情况下，可以十分方便地估算酶制剂的投入量和酶解反应终止时间的关系，估算壳寡糖的生成量，利于酶解法壳寡糖的生产的安排。  

使用本酶制剂要根据实际使用的壳聚糖（生产寡糖的原料）所做的小试来确定酶制剂的使用量。（酶活力的测定与使用的壳聚糖原料有关，企业提供的酶制剂的酶活力仅作参考。）

1、壳聚糖溶液（酶解底物）的配制

利用壳聚糖本身为生物碱，其溶液对酸具有缓冲能力的性质，配制3-6%的壳聚糖盐酸（或其它酸）溶液，并使溶液的pH值在5.4左右。（不使用无机盐缓冲液配制壳聚糖溶液，可减少壳寡糖产物中的无机盐等杂质）

2 、酶制剂

使用本厂制备的浓缩酶液，使用前用重量法（单位时间底物减少量定义活力单位，即一分钟转化一毫克壳聚糖为水溶性组分的酶量为一个活力单位）测定酶活力：取干净试管，每试管中加入10毫升1%壳聚糖（制备壳寡糖的原料）溶液（pH5.4），置 45℃ 恒温水浴中保温，向每试管中加入1毫升酶液（ 45℃ ）立即振荡混匀并开始计时，每隔10分钟（必要时每隔5分钟）向一试管中加入2%NaOH溶液1毫升，立即混匀以终止酶解反应。观察残存壳聚糖沉淀产生的状况（沉淀量和沉淀颗粒的大小等），记录最早没有沉淀产生的试管的酶解时间（T）

酶活力计算：

0.1×1000/T(min) = xxxx活力单位/毫升酶制剂

3、 酶解反应中使用酶制剂量的估算

计算要转化一定量的壳聚糖底物（制备壳寡糖的原料）为水溶性组分，酶解反应时间安排为n小时结束的情况，需要使用多少升的液体型酶制剂（或多少公斤固体型酶制剂）。

 使用酶活力为X单位/毫升的液体型酶制剂  

使用酶活力为Y单位/克的固体酶制剂  

例 一升 3%的壳聚糖溶液要在5小时之内完全转化为水溶性组分需要加入酶活力为5单位/毫升酶液的酶制剂的量（体积）是多少？  

一升 3%壳聚糖溶液中含有 30克 壳聚糖，若五小时完全转化水溶性组分，则需要加入的酶液体积为：

           30×1000/60×5×5 = 0.02(升)= 20（毫升）

此数值只是理论推断，实际上随着酶解时间的延长，部分酶可能变性失活，产物的积累会对酶活性反馈抑制等，因此实际的酶解反应时间可能要比理论上推算的时间要长些。可根据实际实验的结果决定投入酶液的多少。

  一般在 45℃ ，pH5.4左右进行酶解反应，酶解反应终止时，除调节pH使残存壳聚糖沉淀外，应使壳聚糖酶变性失活，否则壳寡糖依然会被继续水解，使产物中的低聚合度的寡糖组分增多。

4 固体型壳聚糖酶制剂的使用方法：

固体酶制剂含有1/2的壳聚糖及低分子量水溶性壳聚糖作为稳定剂。 1克 固体酶制剂加水24毫升制成酶液，可能有不溶物，这是酶制剂中的稳定剂壳聚糖，酶解反应过程中，在最适pH5.4左右的条件下自然会溶解并被水解。

酶解产物（催化壳聚糖水解的产物）分析:

一 使用脱乙酰度80%左右的壳聚糖进行有限度水解，酶解产物通过膜分离技术处理得到的壳寡糖产品的分析：

1 平均分子量和分散度的测定

测定方法：高效液相色谱（HPLC），凝胶渗透色谱法（GPC）分析

检测单位：武汉大学资源与环境科学学院，武汉大学甲壳素研究开发中心

检测结果：平均分子量Mz为2817.1   分散度（MZ/MN ）为1.37981

样品的GPC图谱

GPC分析得出的数据

2 壳寡糖聚合度分布范围的测定

检测方法：基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF- MS) 分析

检测单位：湖南师范大学生命科学学院

检测结果：

①寡糖分离纯化工艺1得到样品的  MALDI-TOF- MS分析结果

寡糖分离纯化工艺1得到样品的  MALDI-TOF- MS谱图

本公司根据MALDI-TOF- MS谱图所作的壳寡糖聚合度分布的分析结果：

样品聚合度分布范围：壳寡糖峰得质核比（M/Z）呈正态分布，壳寡糖聚合度分布范围为5糖- 12糖 其中壳8糖相对含量最高 。

② 寡糖分离纯化工艺2得到样品的  MALDI-TOF- MS分析结果  

                   寡糖分离纯化工艺2得到样品的  MALDI-TOF- MS谱图

本公司根据MALDI-TOF- MS谱图所作的壳寡糖聚合度分布的分析结果：

样品聚合度分布范围：壳寡糖峰得质核比（M/Z）呈正态分布，壳寡糖聚合度分布范围为6-9糖，其中6-8糖的相对含量约为63.55%  

二、 使用脱乙酰度95%的壳聚糖进行较为充分的水解，酶解产物通过膜分离技术处理得到的壳寡糖产品的分析：

1、 平均分子量和分散度的测定

测定方法：高效液相色谱（HPLC），凝胶渗透色谱法（GPC）分析

检测单位：武汉大学资源与环境科学学院，武汉大学甲壳素研究开发中心

检测结果：平均分子量Mz为1079.2  分散度（Mz/Mn）为1.13320

样品的GPC图谱

GPC分析得出的数据 ：

2、 壳寡糖聚合度分布范围的测定

检测方法：基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF- MS) 分析

检测单位：科学技术部 中国科学院 教育部 北京质谱中心

检测结果：

①壳寡糖纯化工艺3制备的样品MALDI-TOF- MS检测结果

样品3#（壳寡糖纯化工艺3制备）的基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱图

本公司根据MALDI-TOF- MS谱图所作的壳寡糖聚合度分布的分析结果：

样品3#中壳寡糖聚合度分布及其相对含量

样品3#中全脱乙酰基壳寡糖（均一壳寡糖）的相对含量

壳寡糖样品中，5-10糖的相对含量约为42.81%,

其中 ：五糖相对含量17.70%（无杂寡糖）

       六糖相对含量11.18%（全脱乙酰基壳六糖4.97%）

② 壳寡糖纯化工艺4制备的样品MALDI-TOF- MS检测结果  

样品4#（壳寡糖纯化工艺4制备）的基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱图

本公司根据MALDI-TOF- MS谱图所作的壳寡糖聚合度分布的分析结果：

样品4#中壳寡糖聚合度分布及其相对含量

样品4#中全脱乙酰基壳寡糖（均一壳寡糖）的相对含量

壳寡糖样品中5-10糖的相对含量约为39.58%，

其中： 五糖相对含量14. 57%（全脱乙酰基壳五糖12.59%）

      六糖相对含量11.33%（全脱乙酰基壳六糖8.63%）

*GS-壳聚糖酶的酶活力规定： 45℃ pH5.4 条件下，一分钟转化1毫克的壳聚糖为水溶性组分的酶量为一个活力单位。